بروزرسانی : يکشنبه 15 شهريور 1388
محیط های کشت باکتریایی

دارو درمان - ازمایشگاه - میکروبیولوژی

محیط کشت آگار خوندار Blood agar

محیط کشت عمومی است که به منظور تکثیر و جدا سازی باکتریهای بیماریزا بخصوص باکتریهایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند، بکار می رود.بعلاوه در این محیط وجود همولیزین در باکتریها را نیز می توان کاوش کرد.

پس از اتوکلاو محیط پایه هنگامی که درجه آن تا حدود 50 درجه سانتیگرا د رسید، خون دفیبرینه گاو را به نسبت 5 تا 7 درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیتهای استریل می ریزیم.

ممکن است بسته به نوع باکتری یکی از سه حالت ذیل مشاهده گردد.

1-همولیز کاملβ:باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده واطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد میگردد.                                                        

2- همولیز ناقصα:باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از 50 درصد می باشد و اطراف پرگنه هاله سبز رنگ ایجاد می گردد.

 3-عدم همولیزγ :باکتری فاقد آنزیم همولیزین می باشد

محیط کشت آگار شکلاته Chocolate agar   

اگر به محیط پایه آگار خوندار هنگامی که درجه حرارت آن بعد از اتوکلاو درحدود 80-70 درجه سانتیگراد باشد ، خون دفیبرینه گاو اضافه کنیم ، محیط کشت آگار شکلاته بدست می آید. 

در این محیط بعلت اینکه گلبولهای قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای آن خارج گشته ، برای رشد باکتریهایی نظیر هموفیلوس و نایسریاها که نیاز بیشتری به مواد غذایی  آماده دارند مناسب می باشد.

همانند محیط کشت آگار خوندار Blood agar بسته به نوع باکتری همولیز ویا همولیز ناقص وعدم همولیز ایجاد میگردد.                              

محیط کشت بریلیانت گرین آگار Briliant green agar

محیطی است انتخابی و برای جداسازی گونه های سالمونلا بکار می رود. این محیط از رشد بسیاری از باکتریها ی روده ای (انتروباکتریاسه)  به جز سالمونلا جلوگیری می نماید. در صورتی که Ecoli ،کلبسیلا و پروتئوس و سایر انترو باکتریاسه ها  رشد نمایند ، به دلیل اینکه قند لاکتوز ویا سوکروز ویا هر دو را تخمیر می نمایند و تولید اسید می کنند، در مجاورت معرف رنگی فنل رد به رنگ زرد در می آیند .در صورتی که باکتری های لاکتوز منفی مانند سالمونلا رشد نمایند ، به دلیل عدم تخمیر قند در مجاورت معرف ، محیط به رنگ ارغوانی در می آید.                                                     

محیط  کشت مک کانکی آگار Macconkey agar  

محیط انتخابی است که برای جداسازی و تعیین هویت باکتریهای گرم منفی می باشد. املاح صفراوی و کریستال ویوله مانع از رشد باکتریهای گرم مثبت می شوند. باکتریهای تخمیر کننده ی لاکتوز (لاکتوز مثبتها) کلنیهایی به رنگ ارغوانی و باکتریهاییی که قادر به تخمیر نیستند (لاکتوز منفیها )کلنیهایی بی رنگ ایجاد می نمایند.

رنگ ارغوانی کلنیهای باکتریهای لاکتوز مثبت مربوط به واکنش اسیدی است که در نتیجه تخمیر قند لاکتوز در مجاورت املاح صفراوی و جذب نوترال رد حاصل شده است.

معرف نوترال رد در محیط قلیایی بی رنگ و در محیط اسیدی قرمز رنگ است.

محیط کشت سابور دکستروز آگار  Saborad Dextrose agar

 محیط انتخابی برای تکثیر قارچها می باشد،که بسیاری از باکتریها نیز در این محیط رشد می کنند . انتخابی بودن این محیط برای قارچها بر اساس PH پایین و همچنین مواد غذایی ناچیز آن است .

محیط  کشت  DNASE 

باکتریهایی که حاوی آنزیم دی اکسی رایبو نوکلئاز باشند ، هاله صورتی رنگی اطراف کلنیها پدید می آورند. تولوئیدن آبی در حضور  DNA سالم به رنگ آبی است. ولی در صورت ریختن  HCL ی نرمال موجب تخریب مولکول DNA شده و این ترکیب به رنگ صورتی در می آید.

محیط کشت مولر هینتون آگار   Mueller hinton agar

کاربرد اصلی این محیط جهت تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی باکتریها ( آنتی بیوگرام ) به روش دیسک می باشد .بسیاری از باکتریها یی که سخت رشد  Fastisious می باشند نظیر  Neisseria meningitides  N.gonorrhoeae  در آن رشد می یابند.                                                

محیط  کشت فلچر       Fleche’s  medium

این محیط برای جداسازی و نگهداری لپتوسپیراها بکار می رود. پس از استریلیزه کردن و خنک نمودن محیط ، به آن 80 میلی لیتر سرم خرگوش استریل اضافه نموده ، سپس به مقدار 7-5 میلی لیتر در لوله های استریل ریخته به مدت 30 دقیقه در حرارت 56 درجه سانتیگراد قرار می دهیم، تا عامل مکمل موجود در سرم غیر فعال گردد.

برای جداسازی لپتوسپیرا، نمونه های خون-ادرار و نسج مشکوک رادر این محیط کشت داده ودر حرارت 29درجه سانتیگراد به مدت 30 روز انکوبه می نماییم. متناوبا از کشت گسترش تهیه کرده وبوسیله میکروسکوپ با زمینه تاریک کشت را کنترل می نماییم.

در اثر تکثیر لپتوسپراها کدورت جزئی در محیط به وجود می آورند که پیدایش یک حلقه شیری رنگ در قسمت بالای محیط می تواند حاکی از رشد لپتوسپرا باشد.

محیط کشت متیل رد – وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth (MR-VP)

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرمها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن  از این محیط استفاده می شود.

آزمایش  MR: پس از انجام کشت و انکوباسیون 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت ، مقدار 6/0 میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.                                                                         

                                                                                                                                                    

نتیجه: ظهور رنگ قرمز---------آزمایش مثبت  (PH=4/4)

        ظهور رنگ نارنجی-------آزمایش مثبت ضعیف(PH=5/3)

        ظهور رنگ زرد ---------آزمایش منفی (PH=5/3)

طرز تهیه معرف :MR

1-متیل رد    --------  04/0 گرم

2-اتانول      -------- 40 میلی لیتر

3-|آب مقطر --------  100 میلی لیتر

متیل رد را در اتانول حل نموده و به حجم 100 میلی لیتر می رسانیم .

آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود6/0 میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار 2/0 میلی لیتر محلول پتاس (معرف B)  اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آنرا به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی  تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت ،واگر تغییر رنگی صورت نپذیرد ، آزمایش VP منفی خواهد بود.

نتیجه: مثبت=  ظهور رنگ صورتی تا قرمز

        منفی=  تغییر رنگی صورت نمی گیرد.

طرز تهیه معرف VP:

معرف A :

1-آلفانفتول  -------------  5 گرم

2-الکل اتلیک مطلق-------  100 میلی لیتر

محلول نباید تیره تر از رنگ کاه(نی) شود در صورت لزوم باید مجددا تقطیر گردد.

معرف B :                                                                             

1-هیدروکسید پتاسیم -----  40 گرم

2-آب مقطر  ------------  100 میلی لیتر

محیط کشت سلنیت  F براث  Selenite  F  broth

محیط مغذی است برای جدا سازی گونه های سالمونلاها .که یک محیط غنی کننده  Enrichment می باشد که حاوی سلنیت سدیم است که یک نمک صفراوی است و مانع از رشد باکتری های گرم مثبت و بسیاری از باکتری های گرم منفی میگردد.میزان تکثیر سالمونلا در این محیط طی 24-12 ساعت اول از رشد هر یک از باکتریهای روده ای سریعتر است .بنابر این کشت ثانوی باکتری  در محیطهای دیگر باید ظرف همان روز (24-12 ساعت) انجام گردد. 

باید توجه داشت این محیط در صورت ماندن و کهنه شدن خراب شده و رنگ آن به صورتی می گراید. بنابر این هرچه کم رنگتر باشد ، تازه تر و برای کشت مناسبتر خواهد بود.

محیط کشت  SIM    ((Sulfide-Indol-Motility

با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری ها می توان بکار برد. به طریقه Stab  تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز  در این محیط کشت می دهیم.

اساس آزمایش:مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است.قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد.

ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد و درصورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است ،انتشار می یابد .سیاه شدن محصول واکنش هیدروزن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد.با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس  Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت 24 ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است .باکتریهای که حاوی مجموعه آنزیمهایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند ،باشند قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.

حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد.باکتریهای فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است،کدر می کنند.برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.

روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول :                                     

فسفو دی متیل آمینو بنزآلدئید    ------------------   5 گرم

ایزو آمیل الکل                      -------------------  75 میلی لیتر

اسید کلریدریک                   -------------------  25 میلی لیتر

آلدئید را در الکل به آرامی حل نموده واز بنماری 55-50 درجه سانتیگراد استفاده نموده و به آن اسید اضافه رده و دور از نور و در 4 درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم .رنگ معرف باید از زرد روشن تا قهوهای روشن باشد. بعضی از نمونه ها آمیل الکل کافی نیست و با آلدئید رنگ سیاه می دهد.

محیط آبگوشت حاوی 5/6 درصد نمک  6.5%  Nacl broth))

استرپتوکوکهای روده ای را که غلظت زیاد نمک را تحمل می کنند، می توان به کمک این محیط از سایر استرپتوکوکها تشخیص داد.

تفسیر آزمایش:از آنجا که تمام استرپتوکوکها از تخمیر گلوکز اسید تولید می کنند در صورتی که این غلظت نمک را تحمل کنند و در این محیط رشد و تکثیر نمایند ،از تخمیر گلوکز اسید تولید و محیط را به رنگ زرد در می آورند عدم تغییر رنگ دلیل بر عدم تحمل نمک و عدم تکثیر باکتری است.

نتیجه:ظهور رنگ زرد   ----- مثبت

       بدون تغییر رنگ------- منفی      

محیط کشت لیزین دکربوکسیلاز Lysine decarboxylase broth

این محیط توان باکتری را در دکربوکسیله نمودن اسید آمینه لیزین ،تعیین می نماید. حاصل این واکنش تولید آلکالین آمین و کادوارین می باشد. به عنوان محیط تفریقی در تمایز بین آنتروباکتریاسه ها به کار برده می شود.

تفسیر آزمایش:از آنجا که همه آنتروباکتریاسه ها در نتیجه تخمیر قند گلوکز ،اسید تولید نموده و محیط را به رنگ زرد  در می آورند ،محیط به رنگ زرد باقی خواهد ماند ،مگر آنکه باکتری اسید آمینه مورد نظر را نیز دکربوکسیله کند. در این صورت قلیائیت حاصله، محیط به رنگ  بنفش (قلیایی) در خواهد آمد.

نتیجه:رنگ بنفش -------- مثبت

     رنگ زرد --------- منفی

 محیط کشت گزیلوز لیزین دزوکسی کولات  آگار (XLD)  Xylose-lysin-decarboxycholate-agar

محیطی است انتخابی که از آن  برای جدا سازی گونه های Shigella و سایر باکتریهای پاتوژن روده ای بکار می رود.

کلی فرم ها و دیگر باکتریها یی که قادر به تخمیر یک یا هر دو قند موجود در محیط باشند، کلنی هایی به رنگ زرد پدید می آورند.(اسید) تخمیر کننده های گزیلوز که لاکتوز و سوکروز منفی هستند مانند Proteus mirabilis واکنش اسیدی خفیفی (نارنجی-کهربایی) ایجاد می کنند .گونه ها Shigella که عموما هیچیک از این قندها را تخمیر نمی کنند،سرتاسر محیط لوله را به حالت قلیایی (قرمز-تیره) در می آورند.

گونه های Salmonella اگر چه معمولا گزیلوز مثبت هستند،ولی به واسطه برتری داشتن دکربوکسیلاسیون لیزین بر اسیدیته تخمیر گزیلوز ،محیط کاملا به رنگ قرمز (قلیایی)در می آید.کلنی های همه باکتری هایی که H2S تولید می کنند،بدون توجه به اسیدیته ، مرکزی سیاه دارند. 

                                                                                                            .                               

محیط کشت برد پارکرآگار Baird parker agar    

یک محیط ( Medium) انتخابی است که حاوی تلوریت پتاسیم و تلوریت لیتیم می باشد. تلوریت محیط از رشد کلی فرم ها ممانعت می نماید. استافیلوکوک اورئوس میتواند تلوریت را به تلورید تبدیل نموده و باعث ایجاد کلنی های سیاه بر روی محیط گردد. زرده ی اضافه شده به محیط نیز باعث ایجاد دو واکنش در محیط می گردد. یکی تولید لسیتینازمنجر به ناحیه کدر ودیگری تولید لیپاز که منجر به ناحیه شفاف در اطراف ناحیه کدر می شود. در انتها کلنی های مشکوک به  استافیلوکوک اورئوس باید تست کواگولاز انجام گردد.      

                                                                                                       

محیط کشت اسکولین براث  Esculin broth

محیط کشت تفریقی است که در تعیین هویت عده ای از باکتری ها مانند انترو باکتریاسه،اکتینوباسیلوسها، از آن استفاده می شود.

بعضی از باکتری ها قادرند اسکولین را که نوعی گلیکوزید می باشد هیدرولیز کرده و آنرا به گلوکز،آگلایکن وآسکولتین تبدیل نمایند. در این فرایند آهن موجود در محیط واکنش نشان داده و ترکیبی به رنگ قهوه ای مایل به سیاه ایجاد می نماید.بنابراین تغییر رنگ محیط از زرد شفاف به سیاه ویا قهوه ای به معنی مثبت بودن آزمایش آسکولین می باشد.            

                                                                                          

                                                      

محیط کشت آبگوشت نیترات  Nitrate broth

از این محیط می توان در تعیین توان باکتری در احیای نیترات و تبدیل ان به نیتریت و مواد احیا شده دیگر بکار برد. بسیاری از باکتری ها را می توان از این جهت مورد آزمایش قرار داد، از جمله کورینه باکتریها ، باسیلوسها و اکتینومایستهاو...

پس از کشت باید به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه نموده و پس از آن از هر یک از معرفهای ذیل 5 قطره به محیط اضافه نموده به طوریکه متوجه ظهور رنگ قرمز باشیم.

تفسیر ازمایش: رنگ قرمز مربوط به پارا سولفور بنزن  و آزونفتیل آمین می باشد،که نوعی رنگ آزو(Azo dye)است که در نتیجه دیازوتیازاسیون اسید سولفانیلیک به وسیله نیتریت و همچنین در اثر ترکیب نفتیل آمین با اتم انتهایی آزوتیازید ،اسید سولفانیلیک حاصل می گردد. در صورتی که احیای نیترات از حد نیتریت هم گذشته و به مراحل تولید گاز ازت N2 یا آمونیاک3 NH رسیده باشد، به علت عدم وجود نیتریت در محیط با افزودن معرفهای ذیل تغییر رنگی ظاهر نمی شود. در حقیقت نتیجه آزمایش منفی کاذب است.به منظور تمایز منفی کاذب از منفی حقیقی، به محیط (پس از افزودن معرفها و منفی شدن)کمی پودر روی اضافه نموده، در صورتی که نیترات در محیط باقی مانده باشد یعنی باکتری آنرا به نیتریت تبدیل نکرده باشد، پودر روی ،نیترات را به نیتریت احیا و رنگ قرمز ظاهر می گردد. عدم تغییر رنگ در این مرحله حاکی از عدم وجود نیترات در محیط است. و این به آن معنی است که باکتری نیترات را از مرز نیتریت هم بیشتر احیا نموده و به گازهای ازت و آمونیاک تبدیل کرده است.

نتیجه پس از افزودن پودر روی:

1- ظهور رنگ قرمز -------------- نیترات منفی                       

 2-عدم تغییر رنگ  ---------------  نیترات مثب                     .

معرف تست نیتریت     ( Nitrit test reagent)   

محلول (A):

-اسید سولفانیلیک :          8 گرم

-اسید استیک (5نرمال) :  1 قسمت اسید استیک گلاسیال و 5/2 قسمت آب مقطر

محلول (B) :                                                                                                                                        

-دی متیل 1-آلفا-1 نفتال آمین :  5 گرم

-اسید استیک (5نرمال)  :        1000 میلی لیتر

.

محیط کشت آگار انتخابی ویبریو Vibrio selective agar (TCBS agar)

آگار تیو سولفات سیترات بایل ساکارز جهت جداسازی و کشت انتخابی ویبریوها بکار می رود. غلظت بالای تیو سولفات و سیترات و قلیایی قوی این محیط رشد انتروباکتریاسه ها را تا حد زیادی متوقف می سازد. هر باکتری که بتواند در این محیط رشد کند، قادر به متابولیزه کردن ساکارز نمی باشد. فقط چند گونه ساکارز مثبت پروتئوس می توانند رشد نموده و کلنی های زرد مشابه ویبریو تولید نمایند. اندیکاتور مخلوط تیمول بلو-بروموتیمول بلو با تشکیل اسید به رنگ زرد تغییر رنگ می دهد.(حتی با وجودی که درجه قلیائیت آن بالاست)

محیط کشت کمپیلو باکتر سلکتیو آگار      Campylobacter Selective Agar Base

از این محیط جهت جداسازی کمپیلو باکترها استفاده می گردد. در این محیط کشت که سرشار از مواد مغذی ،اتمسفری با دی اکسید کربن کم و سرشار از دی اکسید کربن(Co2) مطمئنا کمپیلوباکتر بخوبی رشد یافته و آنتی بیوتیکهایی که بعنوان مکمل انتخابی کمپیلو باکتر به محیط اضافه می شوند تاحد زیادی رشد فلورای میکروبی را مهار می نماید. محیط انتخابی کمپیلو باکتر مخلوطی از سه آنتی بیوتیک متفاوت لیوفیلیزه می باشد. این مکمل رشد باکتریهای همراه در طول کشت متوقف می سازد. هر ویال شامل 2 میلی گرم وانکو مایسین ،5 میکروگرم پلی میکسین و 1 میلی گرم تریمتو پریم می باشد.

ماده لیوفلیزه را جهت تهیه آگار  انتخابی کمپیلوباکتر به محیط کشت استریل که به دمای 50-40 درجه سانتیگراد رسیده اضافه می کنیم.

محیط کشت SS       Salmonella Shigella agar

یک محیط انتخابی است که جهت تشخیص سالمونلا و شیگلا مورد استفاده قرار می گیرد. این محیط حاوی تیو سولفات سدیم بعنوان منبع گوگرد و آهن فریک بعنوان منبع آهن می باشد. وهمچنین حاوی لاکتوز و معرف نوترال رد می باشد .اگر باکتری تیوسولفات محیط را احیا کند، H2S  تولید نموده که H2S با آهن موجود در محیط تولید پرگنه های سیاه رنگ می نماید . اکثر باکتری های لاکتوز مانند سالمونلا ها H2S مثبت میباشند.                                                                        

                                                                              

محیط کشت  ONPG  (Orthonitro Phenul –β-D-galacto Pyramside)

با این محیط می توان وجود آنزیم بتا گالاکتوزیداز یعنی آنزیمی را که موجب شکستن مولکول لاکتوز می گردد را تعیین می نماید. مهمترین کاربرد این آزمایش تعیین سریع لاکتوز مثبتهای تاخیری در بین خانواده انترویاسه می باشد. باکتریهایی که دارای آنزیم بتا گالاکتوزیدازباشند ،  ONPG  بی رنگ را سریعا شکسته وبه  د-گالاکتوز ارتونیتروفنل زرد رنگ تبدیل می نماید.

اگر باکتری واجد هر دو آنزیم یعنی پرمه آز و بتا گالاکتو زیداز  باشد پس از 24 ساعت لاکتوز مثبت است. اگر باکتری واجد یکی از دو آنزیم فوق باشد . پس از 72 ساعت با تاخیر لاکتوز مثبت است ،واگر هیچ یک از آنزیمها را نداشه باشد ،لاکتوز مثبت است.                                                         

محیط کشت فنیل آلانین د آمیناز Phenylalanine deaminase agar (PD)  

با استفاده از این محیط می توان قدرت باکتری را در تولید فنیل پیروویک اسید از اسید آمینه فنیل آلانین را تعیین .پس از یک شب انکوباسیون محیط چند قطره محلول 10 درصد کلرور آهن را روی قسمت کشت شده محیط (سطح شیبدار محیط) ریخته ،در صورتی که واکنش دی آمیناسیون صورت گرفته باشد.با افزودن معرف ،رنگ سبز ظاهر خواهد شد. این رنگ سبز نتیجه شلاته  Chlate شدن فنیل پیرووات با یون آهن ایجاد یک ترکیب به رنگ سبز می باشد.در صورت پیدایش رنگ سبز تیره  PD مثبت ودر بدون تغییر (زرد رنگ) PD منفی است.

محیط کشت سیمون سیترات  آگار  Simmons Citrate agar

برای تعیین قدرت باکتری در استفاده از سیترات به عنوان تنها عامل کربندار موجود در محیط میباشد. باکتریهایی که قادر به رشد در این محیط باشند در حقیقت توانسته اند از سیترات که تنها عامل کربن دار در محیط است استفاده کنند و در نتیجه در مجاورت معرف رنگی بروموتیمول بلو به رنگ آبی در می آیند.در غیر این صورت به علت عدم رشد باکتری و عدم تغییر رنگ محیط  آزمایش سیترات منفی است. 

                                                               

محیط کشت سه قندی آهن دار ( TSI)    Triple Sugar iron agar

از این محیط جهت تعیین هویت باکتریهای گرم منفی استفاده می شود. همچنین برای تعیین تولید  H2S بکار می رود.این محیط دارای سه قند گلوکز-سوکروز و لاکتوز می باشد مقدار کمتر گلوکز در قیاس با دو قند دیگر تمایز باکتریها را در تخمیر قندهای مختلف ممکن می سازد. آهن موجود در محیط گاز هیدروژن سولفوره ای را که از مواد گوگرد دار تولید می شود را به دام انداخته و مانع از خروج این گاز از محیط می شود .این واکنش به صورت رنگ سیاه که همان سولفور آهن است مشخص می گردد.گازی که در نتیجه تخمیرمواد قندی حاصل می شود به صورت حبابهایی در عمق محیط دیده می شوند،ویا اینکه حجم گاز ممکن است زیاد بوده که در این صورت محیط آگار را به سمت بالای لوله رانده و فضای زیادی را اشغال می سازد.

نتایج تفسیر واکنشهای      :   TSI

1-در صورتی که هر دو قسمت شیب دار  و ته لوله زرد شده و حباب تشکیل گشته ولی سیاه نشده باشد.یعنی گلوکز ،لاکتوز و سوکروز را تخمیر نموده و اسد تولید کرده و همچنین گاز نیز تولید نموده ولی H2S تولید نشده است  acid/acid ، Gaz+ ،- H2S  می باشد.                                               

2- در صورتی که ته لوله زرد و شیب لوله ارغوانی و گاز تولید و سیاه باشد ،یعنی تنها قند گلوکز تخمیر شده و H2S نیز تولید شده است. Acid Alk/ ، Gaz+ ،+H2S  می باشد.

3- در صورتی که ته لوله زرد و شیب لوله ارغوانی و تولید و سیاه  شده  باشد، یعنی اینکه تنها گلوکز را تخمیرنموده و H2S تولید نشده است . Alk/Acid ، Gaz- ،- H2S  می باشد. 

 4- در صورتی که ته لوله و شیب لوله هر دو زرد و گاز متغیر باشد و  ته لوله لوله نیز سیاه شده باشد، یعنی اینکه هر سه قند را تخمیر نموده و  H2S نیز تولید نکرده است. acid/acid ، Gaz متغیر  ،+ H2S  می باشد.

5- در صورتی که سرتاسر لوله ارغوانی و سیاه نشده باشد، یعنی اینکه هیچ یک از قندها را تخمیر ننموده و H2S نیز تولید نکرده است. Alk/Alk ،  Gaz- ،- H2S  می باشد       

6- در صورتی که سرتا سر لوله زرد و گاز  و سیاهی در ته لوله متغیر باشد ، یعنی اینکه هر سه قند را تخمیر نموده و تنها اسید تولید کرده ، گاز و H2S تولید ننموده است. acid/acid ،  Gaz- ،- H2S  می باشد.   

نکته : باید توجه داشت که نتایج کشت  حداکثر طی 24 ساعت پس از کشت قرائت گردد،چه بسا پس از این مدت ممکن است واکنشهای اسیدی قسمت شیبدار  تغییر یافته و قلیایی گردد.قسمتی از این تغییر واکنش اسیدی به قلیایی مربوط به این است که ذخیره کربوهیدرات های موجود در محیط تماما مصرف شده که در این صورت باکتری به مواد پپتون دار محیط رو می آورد و همچنین مقدار ناچیز اسیدی که در اثر تخمیر گلوکز حاصل شده به سرعت در مجاورت هوا (قسمت شیبدار ) اکسید شده و ما حصل قلیایی است.در عمق لوله نیز به سبب فشار کم اکسیژن واکنش اسیدی حاصل از تخمیر قند گلوکز و همچنان اسیدی باقی می ماند.

محیط کشت ژلاتین    Gelatin medium      

این محیط به منظور تعیین فعالیت پروتئولیتیکی باکتریها می باشد.باکتریهای پروتئولیتیک همیشه باکتریها را ذوب می کنند.در صورتی که کشت ژلاتین در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قرار داده شود،باید قبل از قرائت لوله های حاوی کشت ژلاتین را در دمای یخچال 4 درجه به مدت 15 دقیقه قرار داده ، در صورتی که باکتری آنزیم ژلاتیناز را داشته باشد ،لوله های کشت ژلاتین پس از انکوباسیون در یخچال به صورت مایع خواهند بود. در غیر اینصورت باکتری فاقد آنزیم ژلاتیناز می باشد.

توجه: نقطه ذوب محیط ژلاتین 30-20 درجه سانتی گراد می باشد.

محیط کشت       Oxidative Fermentative    OF

با کشت باکتری در این محیط می توان مشخص نمود که استفاده باکتری از کربوهیدرات از طریق اکسیداسیون یا از طریق تخمیر صورت کرفته است .این محیط را در دو قسمت ،یکی حاوی پارافین و دیگری فاقد پارافین تهیه نموده و از نمونه در هر دو محیط کشت می دهیم.در صورتی که باکتری تنها از طریق اکسیداسیون قند را مورد استفاده قرار دهد،تنها در لوله ی فاقد پارافین قند را مصرف کرده و محیط را اسیدی نموده،که در مجاورت معرف بروموتیمول بلو به رنگ زرد در می آید.رنگ زرد ازبالای لوله شروع می شودکه باکتری از طریق فرمنتاتیو قندها را تخمیر نماید،هر دو لوله ی کشت ( حاوی پارافین و فاقد پارافین ) بر اثر تولید اسید شاهد ظهور رنگ زرد خواهیم بود. از محیط OF می توان در تمایز کوکسی های گرم مثبت بخصوص استافیلوکوک اورئوس استفاده نمود .

تست اکسیداز  Oxidase test : 3-2 قطره معرف اکسیداز (محلول آبی تترامتیل –فسفات-فنیل آلانیل دی هیدروکلراید روی یک کاغذ صافی در یک پلیت قرار داده(قطرات روی کاغذ صافی خشک شوند)و میکروب مورد آزمایش را با یک سیم پلاتینیوم Platinium wire برداشته و آن را روی کاغذ آغشته به معرف اکسیداز گسترانیده و واکنش مثبت در مدت 10 ثانیه بصورت ایجاد رنگ سیاه مایل به صورتی مشاهده می گردد.

آزمایش کواگولاز   Coagulase test

با استفاده از این آزمایش میتوان وجود آنزیم کواگولاز در باکتری استافیلوکوک اورئوس  را مشخص نمود. آنزیم کواگولاز آنزیمی است که باعث لخته شدن پلاسمای سیتراته خرگوش می شود. با توجه به اینکه سیترات ماده ضد انعقاد می باشد ، اما کواگولاز می تواند حتی در حضور ماده ضد انعقاد ، پلاسما را لخته نماید. (فیبرینوژن را به فیبرین تبدیل نماید. ) 

تست کاتالاز   Catalase test

با استفاده از این تست می توان وجود آنزیم کاتالاز را در باکتری مشخص نمود.در صورتی که باکتری واجد آنزیم کاتالاز باشد ،با اضافه کرن آب اکسیژنه به کلنی برداشته شده  باکتری بر روی لام ،واکنش انجام شده به صورت تولید آب و اکسیژن بوده که به صورت حبابهایی نمایان میگردد. در صورتی که باکتری فاقد آنزیم کاتالاز باشد ، بعد از اضافه نمودن آب اکسیژنه ، هیچ گونه تغییری در تولید حباب حاصل از تجزیه آب اکسیژنه به آب و اکسیژن ایجاد نمی گردد،و در نهایت باکتری کاتالاز منفی می باشد

محیط کشت ائوزین متیلن بلو       Eosin methylen-blue lactose sucrose agar       (EMB)

این محیط فاقد املاح صفراوی می باشد ،و بیشتر برای باکتری های گرم منفی رودهای مناسب می باشد. باکتری  Ecoliدر این محیط در حضور ائوزین متیلن بلو ایجاد جلای سبز فلزی می نماید،که کلید تشخیصی باکتری  Ecoli نسبت به سایر باکتری های روده ایی می باشد.

                                                                                             

محیط کشت Cookeedmeet

از این محیط برای کشت به دلیل وجود پارافین بر روی محیط کشت باعث رشد  باکتری های بی هوازی می گردد. این محیط کشت محیط مغذی و غنی برای باکتری های بی هوازی منجمله کلستریدیوم است. این محیط معرف خاصی نداشته، و هدف این است که محیط کشت مناسب برای باکتری های بی هوازی ایجاد نمود.بعد از رشد باکتری برای تفریق باید بر روی محیط های افتراقی با شرایط بی هوازی جهت تشخیص باکتری مورد نظر پرداخت.